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Microscopie à deux photons pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle : avantages et enjeuxou Un photon c’est bien… mais deux c’est mieux !

  • Pascal Dufour,
  • Suzie Dufour,
  • Annie Castonguay,
  • Nathalie McCarthy et
  • Yves De Koninck

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  • Pascal Dufour
    Centre d’optique, photonique et laser,
    Département de physique, de génie physique et d’optique,
    Université Laval,
    Québec,
    G1K 7P4 Canada.

  • Suzie Dufour
    Centre d’optique, photonique et laser,
    Département de physique, de génie physique et d’optique,
    Université Laval,
    Québec,
    G1K 7P4 Canada.

  • Annie Castonguay
    Département de Psychiatrie,
    Université Laval,
    Unité de Neurobiologie Cellulaire,
    Centre de recherche Université Laval Robert-Giffard,
    2601, chemin de la Canardière,
    Québec,
    G1J 2G3 Canada.

  • Nathalie McCarthy
    Centre d’optique, photonique et laser,
    Département de physique, de génie physique et d’optique,
    Université Laval,
    Québec,
    G1K 7P4 Canada.

  • Yves De Koninck
    Département de Psychiatrie,
    Université Laval,
    Unité de Neurobiologie Cellulaire,
    Centre de recherche Université Laval Robert-Giffard,
    2601, chemin de la Canardière,
    Québec,
    G1J 2G3 Canada.
    yves.dekoninck@crulrg.ulaval.ca

Corps de l’article

Un des enjeux majeurs de la biochimie et de la biologie cellulaire actuelle est de pouvoir suivre de manière dynamique les événements moléculaires à l’intérieur de la cellule vivante dans son contexte fonctionnel, c’est-à-dire in situ (dans son tissu d’origine). Il apparaît de plus en plus évident que des facteurs spatio-temporels très fins à l’intérieur de la cellule vivante déterminent en grande partie la spécificité des signaux cellulaires. Il suffit de penser aux fluctuations calciques intracellulaires qui participent à une multitude de cascades de signalisation ; sans spécificité spatiale et temporelle, la cellule ne pourrait utiliser les signaux calciques de manière utile et efficace.

Parmi les techniques d’imagerie non-linéaire modernes, la microscopie par excitation à deux photons (M2P) est celle qui a permis de faire les plus grands progrès en ce sens, permettant d’étudier à haute résolution non seulement la structure, mais aussi le fonctionnement moléculaire dans le temps, à l’intérieur de la cellule. Nous passerons ici en revue quelques principes qui sont à la base des avantages de cette technique afin de mettre en relief certains des défis qui demeurent (résolutions, sensibilité, profondeur de pénétration dans le tissu et phototoxicité) pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle. Les exemples présentés sont tirés des neurosciences puisque l’étude du neurone présente probablement les défis les plus grands en termes de résolution spatiale et temporelle. En effet, la taille de certaines ramifications et spécialisations neuronales (<< 1 µm) et la rapidité des signaux neurochimiques, comme ceux qui sont impliqués dans la transmission synaptique (de l’ordre de la ms), sont à la limite de ce que la microscopie optique actuelle permet d’étudier.

La microscopie à deux photons : principes de base

Il est possible pour un atome ou une molécule d’absorber « simultanément » deux photons (2P) ou plus (Figure 1A). On appelle ce phénomène l’absorption à deux photons (A2P). Il a été prédit par Göper-Mayer en 1931 [1] et observé 30 ans plus tard par Kaiser et Garrett [2]. La première observation d’A2P dans un milieu organique a été effectuée par Peticolas et al. [3] quelques années plus tard et la microscopie laser fondée sur l’A2P a été proposée par Sheppard et Kompfner [4]. Cependant, c’est seulement en 1990 que Denk et al. [5] ont rapporté la première application expérimentale de l’A2P à la microscopie laser. Ce type de microscopie est survenu beaucoup plus tard que la découverte de l’A2P puisqu’elle nécessitait l’utilisation d’un laser ayant des impulsions sub-picoseconde. En effet, l’intensité lumineuse utilisée doit être très grande pour que la probabilité soit non négligeable que deux photons passent près de l’atome à exciter dans un laps de temps suffisamment court (10-16 s) pour que leurs actions s’additionnent. Des impulsions de très courte durée (< 200 fs) sont nécessaires afin d’atteindre des intensités suffisantes à l’observation de ce phénomène (voir plus loin).

Figure 1

Principes de microscopie multiphotonique.

A. Schématisation des niveaux d’énergie d’une molécule fluorescente. La flèche bleue représente l’absorption à un photon (1p), les flèches rouges représentent l’absorption à 2 photons (2p) et les grises représentent l’absorption à 3 photons (3p). La flèche pointillée représente le passage vers un niveau d’énergie intermédiaire avant l’émission spontanée d’un photon de fluorescence (flèche verte). B. Schéma expérimental du montage de la M2P conventionnelle. La source d’excitation est dirigée vers l’échantillon via un système de balayage et un miroir dichroïque, puis elle est concentrée au point focal d’excitation par l’objectif. La fluorescence émise par l’échantillon est ensuite collectée par le même objectif, filtrée par un filtre d’émission et détectée par un tube photomultiplicateur (PMT). Le volume d’excitation doit être éclairé pendant un certain temps (appelé pixel dwell time) afin que l’on puisse récolter assez de photons de fluorescence pour produire un signal clair.

Principes de microscopie multiphotonique.

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En M2P, afin d’exciter efficacement les molécules fluorescentes, on focalise les impulsions laser dans un tout petit volume (Figure 1B). Dans ce volume, les molécules de l’échantillon absorbent 2P ayant chacun la moitié de l’énergie (donc le double de la longueur d’onde) nécessaire à leur excitation ; celles-ci réémettent alors généralement un photon (1P) par fluorescence. On peut ensuite reconstituer l’image d’un plan xy de l’échantillon en déplaçant le point focal dans ce plan [6]. On obtient des images en trois dimensions en balayant plusieurs plans à des profondeurs différentes.

Résolution spatiale

La Figure 2A compare l’intensité (absorption à 1P) et l’intensité au carré (2P) de taches focales pour un même objectif, à une longueur d’onde de 450 nm et 800 nm. L’absorption par les molécules fluorescentes étant proportionnelle à l’intensité au carré dans le cas de la M2P [7, 8], cela améliore la résolution pour une longueur d’onde donnée. Le résultat net est que, théoriquement, la résolution radiale est légèrement inférieure avec une excitation à 2P à 800 nm qu’avec 1P à 450 nm (Figure 2A). En revanche, l’intensité au carré diminue plus rapidement sur l’axe z dans le cas à 2P. Cette illustration ne considère cependant pas l’absorption et la diffusion dans les tissus. Or, le coefficient d’absorption de plusieurs des composantes des tissus est au moins 10 fois moins important à 800 qu’à 450 nm (Figure 2B). La diffusion est également inférieure à une longueur d’onde de 800 nm. En microscopie confocale (à 1P), il y a donc beaucoup plus de fluorescence émise hors du point focal (Figure 2C). Cette fluorescence hors foyer devient une source de bruit importante, minant la résolution et la sensibilité du système ; de plus, elle affecte le tissu (phototoxicité) hors du point d’investigation. Pour maintenir une bonne résolution en microscopie confocale, on utilise un sténopé, afin de rejeter les photons émis par fluorescence hors du point focal. Pour un tissu épais (>100 µm), on doit excessivement réduire le diamètre du sténopé et augmenter l’intensité de la lumière incidente. Ceci rend rapidement l’intensité lumineuse hors foyer trop importante, compromettant la détection du signal et l’intégrité du tissu.

Figure 2

Avantages et limites de la M2P pour la résolution spatiale.

A. Images 2D du profil d’intensité lumineuse de points focaux (1P ; dans le plan xz ou yz à 450 et 800 nm, respectivement) et intensité au carré à 800 nm (2P) obtenus par simulation. L’ouverture numérique de l’objectif est de 0,5 et le coefficient d’absorption est nul. La perte de résolution en utilisant une longueur d’onde plus grande (la résolution est proportionnelle à la largeur à mi-hauteur des points focaux) se trouve compensée par le fait que l’absorption de 2P est proportionnelle à l’intensité au carré. Le résultat net est que la résolution radiale avec une excitation à 2P à 800 nm est comparable à celle obtenue avec 1P à 450 nm. B. Coefficient d’absorption des principaux absorbeurs dans les tissus en fonction de la longueur d’onde. Notez l’absorption 10 à 100 fois plus faible à 800 nm qu’à 450 nm (flèches) due à la présence d’éléments absorbant dans le tissu (mélamine, hémoglobine…). C. Profil de l’intensité lumineuse à 1P (gauche) et profil de l’intensité au carré à 2P (droite) obtenus par simulation en tenant compte, cette fois-ci, du coefficient d’absorption. La valeur du coefficient d’absorption est de 85 cm-1 dans le cas à 1P et de 8,5 cm-1 dans le cas à 2P (ouverture numérique = 0,16). D. Image d’un neurone pyramidal du néocortex exprimant la green fluorescent protein (GFP) à faible grossissement à gauche et avec un grossissement croissant vers la droite pour illustrer le détail des prolongements du neurone : le panneau du milieu met en évidence une dendrite ; le panneau de droite les détails d’épines dendritiques. Comme les épines ont une taille de l’ordre du micromètre, la résolution optique standard ne permet pas de distinguer leur structure fine. E. Exemple de technique utilisée pour augmenter la résolution en deçà des limites de diffraction de la lumière : la STED (stimulated emission depletion). On excite l’échantillon avec une impulsion laser de la même façon qu’on le fait en M2P. Par la suite, avant que les fluorophores réémettent la fluorescence, on désexcite les molécules autour du point focal par émission stimulée avec une impulsion en forme de beigne. Le volume d’excitation correspond alors à une soustraction entre le volume d’excitation et le volume de désexcitation autour du point focal. Les molécules encore excitées sont alors dans un volume beaucoup plus petit que le point d’excitation engendré par l’excitation, ce qui améliore la résolution radiale. (E1) présente le profil d’intensité de l’impulsion laser d’excitation, (E2) le profil d’intensité du faisceau en beigne qui suit l’impulsion d’excitation. (E3) montre le profil d’excitation résultant après le passage des deux premières impulsions, (E4) le profil inverse du beigne.

Avantages et limites de la M2P pour la résolution spatiale.

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Ainsi, considérant à la fois le diamètre fini du sténopé, l’importante absorption et la diffusion dans les tissus biologiques aux courtes longueurs d’onde, la M2P permet l’acquisition d’images à de plus grandes profondeurs, tout en ayant une meilleure résolution radiale et axiale en minimisant la taille de la région excitée et le stress imposé au tissu [9].

Il est possible d’utiliser l’absorption à trois photons pour augmenter la résolution spatiale ; celle-ci demeure cependant aussi limitée par la diffraction. Or, plusieurs mouvements moléculaires se font sur des échelles spatiales bien plus petites ; de même, plusieurs compartiments cellulaires (comme l’épine dendritique d’un neurone ; Figure 2D) sont eux-mêmes inférieurs en taille aux limites de diffraction de la lumière. Beaucoup d’efforts sont déployés pour obtenir des résolutions << 100 nm. Mentionnons, comme nouvelles approches, la microscopie 4Pi-confocale, la RESOLFT (reversible saturable optical fluorescence transition), l’illumination structurée et la STED (stimulated emission depletion) [10-13] (Figure 2E). Ces techniques sont cependant complexes et requièrent des alignements de laser très précis. En revanche, on assiste actuellement à l’émergence d’autres approches complémentaires moins complexes [14].

Maximisation du signal de fluorescence/imagerie en profondeur

La M2P offre une meilleure pénétration dans les tissus pour l’imagerie cellulaire par rapport à la microscopie confocale conventionnelle (Figure 3A). Celle-ci demeure toutefois limitée et son amélioration un enjeu important. À cette fin, il faut maximiser la fluorescence provenant du point focal et la détection de ces photons.

Figure 3

Imagerie fonctionnelle en profondeur dans le tissu.

A. Image reconstituée de cellules corticales dans le cerveau intact de souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans une sous-population de neurones corticaux de la couche V. Une projection sur le côté de l’empilement des images permet de visualiser les cellules dans l’axe des z et d’illustrer la capacité d’imager en profondeur dans la matière grise du cortex cérébral (tirée de [16]). B. Graphique de l’intensité en fonction du temps pour un faisceau laser continu (noir) et pour des faisceaux laser pulsés à 100 MHz (bleu), à 10 MHz (vert) et à 250 kHz (rouge). Les faisceaux à 10 MHz et 250 kHz sont engendrés à l’aide d’un amplificateur régénératif. Notons que les quatre faisceaux laser ont la même puissance moyenne (correspondant à la puissance du faisceau continu). C. Imagerie fonctionnelle sur un bouton synaptique. (C1) Schéma de la circuiterie de l’hippocampe chez le rat. Les cellules granulaires (CG) sont situées dans le gyrus denté et envoient leur prolongement axonal dans la région CA3 où ils font synapse au niveau de dendrites proximales des cellules pyramidales. Les boutons synaptiques des CG peuvent être marqués à l’aide d’un indicateur calcique qui servira à rapporter les changements calciques de cette terminaison suite à une stimulation électrique des axones. (C2) Terminaisons en boutons marquées à l’aide de l’indicateur calcique Oregon Green BAPTA1-AM. La terminaison imagée est encadrée en pointillés. (C3)Pour maximiser la résolution temporelle on ne balaye qu’une seule ligne qui passe à travers le bouton. (C4) Les changements de fluorescence sont rapportés sous forme graphique dans le temps. D. Imagerie fonctionnelle d’un large réseau de neurones. (D1) Image en M2P de fluorescence provenant d’un marqueur calcique capturé par un grand nombre de neurones corticaux (plusieurs centaines de neurones peuvent être suivis avec cette méthode). (D2) Exemple de tracés rapportant la fluctuation de fluorescence dans le temps dans deux des neurones du champ en d1. (D3) Ces fluctuations peuvent être comptées à partir d’un seuil de détection donné et (D4) l’activité du réseau peut être reconstituée tel que sur ce raster-plot où chaque ligne représente un neurone (modifié à partir de [31]).

Imagerie fonctionnelle en profondeur dans le tissu.

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Puissance, focalisation et impulsions courtes

Comme la M2P est un phénomène non-linéaire, maximiser l’intensité lumineuse a un impact particulièrement important sur le signal : en doublant l’intensité lumineuse d’excitation, la fluorescence émise est quadruplée. Cependant, une intensité moyenne lumineuse plus élevée (en photon cm-2 s-1) causera une augmentation du dommage au tissu. Il est donc préférable d’optimiser d’autres paramètres. On peut minimiser la taille du point focal en utilisant, par exemple, des objectifs avec la plus grande ouverture numérique possible : focaliser un faisceau laser d’une taille de 1 mm sur 1 μm fait gagner un facteur 106 en intensité crête.

En M2P, le fait de focaliser un faisceau laser intense en un tout petit volume n’est cependant pas suffisant pour obtenir assez de signal de fluorescence dans un court laps de temps (pixel dwell time). Il faut donc exploiter la possibilité de réduire la durée des impulsions laser pour en augmenter l’intensité. Comme la fluorescence dépend de la moyenne de l’intensité au carré [15], avec des impulsions de 100 fs et un taux de répétition de 80 MHz, gamme typique des lasers femtoseconde utilisés en microscopie, l’intensité lumineuse maximale est augmentée par un facteur 105 (donc la fluorescence, par un facteur 1010) sans changer l’intensité moyenne.

Taux de répétition du laser

Pour une impulsion laser d’une largeur temporelle τ et d’un taux de répétition fr, le signal de fluorescence est proportionnel à 1/(τfr)n-1 [16], où n est le nombre de photons absorbés (n = 2 pour l’A2P). Pour augmenter le signal, on peut donc envisager d’utiliser des impulsions plus courtes et un taux de répétition plus faible. Cependant, des impulsions de durée inférieure à 100 fs subiraient un élargissement temporel (dispersion) dans les composantes optiques et dans les tissus. D’autre part, pour réduire fr, l’utilisation d’un amplificateur régénératif permet d’additionner plusieurs impulsions successives afin de produire une impulsion géante (Figure 3B). L’intensité crête peut être multipliée par un facteur 108 en réduisant le taux de répétition à 1 Hz [17] sans changer l’intensité moyenne. En imagerie, puisqu’il faut au moins une impulsion par pixel, on réduit fr par un facteur plus petit ; pour un pixel dwell time de 4-10 μs, on doit réduire le taux de répétition à 100-250 kHz. Puisque cette technique augmente le signal de fluorescence, elle permet aussi d’imager plus en profondeur dans les échantillons [18]. L’apparition significative d’excitation à 2P hors du point focal semble toutefois limiter la profondeur d’imagerie autour de 1 mm [19].

Section efficace des fluorophores

Bien que certains fluorophores aient les mêmes caractéristiques pour l’absorption à 1P ou 2P, plusieurs ont un comportement différent. Certaines molécules comme le NADH (molécule endogène) ont une faible section efficace à 2P tandis que d’autres (GFP, CFP) ont une section efficace acceptable (~100 GM). Un des avantages notables des nanocristaux fluorescents de CdSe-ZnS, dits points quantiques (quantum dots), et qui fait leur popularité croissante en microscopie pour le suivi moléculaire [20], est qu’ils ont une section efficace près de 50 000 GM [21]. En M2P, les profils d’excitation sont également souvent plus large qu’en 1P, permettant d’exciter plus facilement deux fluorophores avec la même longueur d’onde, ce qui peut être très avantageux pour l’analyse par corrélation croisée de plusieurs signaux [22].

Approche alternative

La venue de micro-endoscopes utilisant la technologie du M2P permet d’aller beaucoup plus en profondeur in vivo, particulièrement en neurobiologie où les caractéristiques du tissu se prêtent bien à l’utilisation de cette approche [23] ; il s’agit néanmoins d’une technique plus invasive.

Résolution temporelle

L’imagerie fonctionnelle va au-delà de la morphologie, car elle fait intervenir une dimension supplémentaire, soit le temps. Elle permet donc de suivre l’évolution des composantes présentes dans un environnement vivant et d’étudier les événements et les fonctions reliées à ces composantes. Bien que l’imagerie fonctionnelle fasse souvent référence à des techniques telles que l’imagerie à résonance magnétique (IRM) ou l’imagerie par tomographie à émission de positons (PET), la résolution spatiale nettement supérieure qu’offre la M2P en fait une technique de choix pour l’imagerie fonctionnelle cellulaire et subcellulaire.

Pour disposer d’une bonne résolution temporelle, il faut optimiser le signal de fluorescence, optimiser la détection du signal, optimiser la vitesse de balayage et imager seulement le volume d’intérêt.

Compartimentalisation cellulaire

Le neurone se distingue par son activité électrique et une compartimentalisation de ses sous-unités fonctionnelles (dendrites, axones…). Les méthodes d’électrophysiologie modernes ont permis de faire de grandes avancées pour étudier les événements électriques dans les cellules nerveuses [24] mais ces méthodes se butent à certaines limites. L’une d’elles est la difficulté de suivre les courants synaptiques dans des compartiments très éloignés du coeur de la cellule (boutons synaptiques, ramifications dendritiques). L’imagerie cellulaire fonctionnelle permet de briser ces barrières spatiales et permet d’échantillonner les événements cellulaires dynamiques en plusieurs points d’un même neurone [25-27]. La rapidité de certains événements électriques neuronaux (typiquement de l’ordre de 1-100 ms) présente cependant des défis importants.

La méthode utilisée pour balayer le point focal à l’intérieur de l’échantillon détermine en partie les limites de résolution temporelle de la M2P. On peut déplacer l’objectif ou l’échantillon lui-même ; en pratique, on préfère balayer le faisceau laser sur la lentille (notamment avec des miroirs montés sur des galvanomètres). Avec cette configuration, il est possible d’obtenir une image 2D de 512x512 points en 1/30 s [28], ce qui fournit une résolution temporelle suffisante sur champ large pour suivre la dynamique d’un bon nombre de phénomènes biologiques. Pour certains signaux synaptiques, 30 images/s demeure cependant trop lent. Pour y remédier, on peut limiter l’échantillonnage à une aire réduite, voire à une seule ligne de balayage, comme pour l’imagerie fonctionnelle d’événements synaptiques (Figure 3C) [25-27]. Une autre approche prometteuse est l’utilisation de déflecteurs acousto-optiques, éléments non-mécaniques qui permettent donc d’envisager des déplacements de faisceau beaucoup plus rapides [29].

Activité du réseau

Un des enjeux pour comprendre l’activité neuronale se situe à un autre extrême, celui de suivre l’activité d’un vaste réseau de neurones à l’intérieur du tissu intact. Encore une fois, par rapport aux techniques d’électrophysiologie classique, l’imagerie cellulaire fonctionnelle à 2P offre une solution efficace pour échantillonner l’activité d’un grand nombre de neurones en profondeur dans le tissu (Figure 3D) [30-32]. Cela dit, la haute résolution axiale de la M2P oblige à prendre un grand nombre d’images dans l’axe des z pour capturer l’état d’objets dispersés dans un échantillon épais de tissu, ce qui limite d’autant la résolution temporelle des phénomènes dynamiques à observer. Pour l’étude d’un réseau de neurones dans le cerveau, par exemple, il faut pouvoir obtenir une image à grande vitesse de tout le volume de tissu pour détecter les décharges successives des cellules qui se produisent sur une échelle de temps de quelques ms.

Microscopie avec axicon

Plusieurs approches ont été envisagées pour accélérer l’acquisition d’image en M2P à balayage laser, notamment l’utilisation de matrices de lentilles [33]. Si les cellules à l’étude ne sont pas trop densément groupées, on peut éliminer le besoin de scanner le volume dans l’axe des z, puisque cette information n’est pas nécessairement utile. Pour cela, on peut envisager d’augmenter la profondeur de champ. L’enjeu est cependant de ne pas sacrifier la résolution radiale (dans le plan xy), ce qui se produit avec des objectifs classiques en diminuant l’ouverture numérique, par exemple.

Plusieurs techniques tentent d’augmenter la profondeur de champ des lentilles, comme l’utilisation d’axilens [34] ou de lentilles bi-réfringentes entre deux polariseurs [35]. Ces techniques ont une profondeur de champ limitée et la résolution radiale varie le long de l’axe de propagation. Une alternative intéressante est d’utiliser une lentille conique appelée axicon (Figure 4) qui focalise la lumière sur une ligne d’excitation dans l’axe des z, éliminant ainsi la nécessité d’effectuer des balayages successifs afin d’imager tout le volume d’intérêt. Cet élément optique, compatible avec la M2P, focalise la lumière sur une mince ligne axiale tout en maintenant une résolution radiale comparable à celle d’un objectif conventionnel (Figure 4). On a montré qu’en M2P, un microscope à base d’axicon permet d’obtenir, en un seul balayage, des images fonctionnelles de structures distribuées à différentes profondeurs focales comparables à la somme d’images obtenues avec une lentille conventionnelle [36, 37].

Figure 4

Un microscope à deux photons utilisant un axicon pour maximiser la profondeur de champ sans compromettre la résolution radiale.

A. Schématisation d’un axicon d’angle α. La lumière est focalisée sur une ligne d’excitation qui traversera le plan xy du spécimen à imager. B. Schéma expérimental du montage de la M2P utilisant un axicon. Dans ce cas, c’est l’axicon qui est déplacé transversalement afin de balayer l’échantillon. Le même axicon est utilisé pour récolter la fluorescence émise et la rediriger vers le système de détection. C. Illustration du volume d’excitation et des images résultant du balayage d’un échantillon avec un objectif (haut) et avec un axicon (bas). D. Simulations montrant le profil d’intensité au carré pour une lentille (gauche) et un axicon (droite) (ouverture numérique = 0,16 et coefficient d’absorption = 8,5 cm-1). Pour un axicon de 30°, la ligne focale obtenue est d’une longueur de l’ordre du mm tout en ayant une résolution axiale constante de l’ordre du micron.

Un microscope à deux photons utilisant un axicon pour maximiser la profondeur de champ sans compromettre la résolution radiale.

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Autres applications

Au-delà de l’imagerie, les nombreux avantages de la M2P par rapport à la microscopie confocale (Tableau I) ouvrent la porte à des applications intéressantes pour le traitement de certaines pathologies, notamment sous forme de thérapie dite « photodynamique ». On vise ici à détruire des tissus spécifiques, comme par exemple des tumeurs ou des excroissances. Ces tissus sont au préalable chargés d’un agent photosensible qui, une fois photo activé, devient toxique pour les cellules. Les mêmes avantages de l’optique non-linéaire que ceux présentés ci-dessus pour l’imagerie peuvent être exploités pour cibler le photo-dommage de manière très spécifique : à une profondeur donnée et dans un volume très précis [38].

Parties annexes