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Régulation de p16INK4a, sénescence et oncogenèse

  • Wei Wen Chien and
  • Martine Ffrench

…more information

  • Wei Wen Chien
    Laboratoire de cytologie analytique,
    Faculté de médecine,
    EA3737,
    69373 Lyon Cedex 08,
    France.

  • Martine Ffrench
    Laboratoire d’hématologie,
    CHLS,
    165, chemin du Grand Revoyer,
    69495 Pierre-Bénite Cedex,
    France.
    martine.ffrench@chu-lyon.fr

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La protéine p16INK4a, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines (CDK4 et CDK6) de la phase G1 du cycle cellulaire [1], est impliquée dans l’activité transcriptionnelle de la cellule à plusieurs titres : inhibition de la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome (pRb), inhibition directe de NFκB [2], régulation de l’activité de Myc [3] et inhibition de CDK7, démontrée in vitro [4]. Les conséquences d’une dérégulation de l’expression du gène INK4a peuvent donc être multiples, comme en témoignent la très fréquente association de sa délétion [5] ou de son inactivation par méthylation [6] avec les processus cancéreux, ou encore l’apoptose rapide provoquée par son hyperexpression [7-9].

Protéines p16INK4a et p14ARF

Le locus INK4a/ARF humain, situé sur le chromosome 9 en 9p21, comporte deux gènes, INK4a et ARF, qui expriment respectivement les transcrits α et β : ces transcrits codent pour les protéines p16INK4a et p14ARF (p19ARF chez la souris), distinctes sur les plans structural et fonctionnel [10].

Si l’expression de p16INK4a ne varie pas au cours du cycle cellulaire [11], elle est augmentée dans certains cas d’inhibition fonctionnelle de pRb [12], au cours de la sénescence réplicative [11] ou, encore, lors de l’activation de certaines voies oncogéniques induisant une sénescence prématurée [13]. La protéine p14ARF, quant à elle, s’associe à MDM2 et régule le cycle cellulaire par stabilisation indirecte de p53, qui active le gène de p21CIPI, un autre inhibiteur de CDK [14]. Les voies p16INK4a/pRb et p14ARF/p53/p21 sont également impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN [15].

Chez la souris, l’invalidation du gène INK4a, à l’inverse de celle du gène ARF, ne provoque pas l’apparition de tumeurs spontanées [16]. Chez l’homme, en revanche, les données expérimentales suggèrent que le gène INK4a, plus que le gène ARF, serait un répresseur de tumeur majeur [17-19]. Par ailleurs, dans un contexte de prédisposition familiale au mélanome, les fibroblastes diploïdes humains (FDH), qui présentent une délétion homozygote de 19 nucléotides dans l’exon 2 du locus INK4a/ARF, expriment une protéine p16INK4a non fonctionnelle et une protéine p14ARF fonctionnelle : or ces fibroblastes résistent à la sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras [18]. Chez l’homme, le contrôle de l’expression de p16INK4a constitue donc un pivot essentiel, aussi bien pour la régulation du vieillissement cellulaire que pour la réponse à un stress, en particulier oncogénique.

L’analyse séquentielle du promoteur de INK4a montre différents sites consensus pour la fixation de facteurs de transcription (Figure 1A). Par ailleurs, le promoteur et l’exon 1 de INK4a présentent un îlot CpG [6] qui recouvre un certain nombre de ces sites consensus (Figure 1B) ; sa méthylation, anormale, induit l’extinction du gène.

Figure 1

Le promoteur de INK4a.

Le promoteur de INK4a.

A. Séquence de la région promotrice de INK4a (GenBank : X94154) et sites consensus de fixation de ses facteurs régulateurs : sites Ets [23], boîtes E [25], sites de Sp1 [44], site de RHA [44] et site de ITSE [48]. B. L’extrémité 5’ de INK4a présente un îlot CpG incluant l’exon 1 et 139 pb en amont de celui-ci. L’exon 1 comporte 340 pb : +1 indique le premier nucléotide de traduction ; les 104 premiers nucléotides de l’exon 1 correspondent à une région non codante ; les extrémités de l’exon 1 sont annotées –104 et +236 (GenBank : U12818) [6].

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Bien qu’une régulation post-transcriptionnelle de INK4a ait été décrite [20], l’analyse conjointe de l’ARNm et de la protéine montre que c’est essentiellement au niveau transcriptionnel qu’intervient sa régulation [11, 12, 21] : l’étude de la transcription d’INK4a devrait donc permettre de déterminer les facteurs impliqués dans sa régulation, et donc dans la sénescence cellulaire, facteurs dont le dérèglement serait à l’origine du développement de tumeurs.

Facteurs activateurs et inhibiteurs de la transcription d’INK4a

Activateurs de la transcription

Protéines Ets1 et Ets2

Ets1 et Ets2 (Ets1/2) activent le promoteur de INK4a en réponse à l’activation de la voie Ras/Raf/MEK : de fait, l’activation des oncogènes Ras [13] ou Raf [22], ou celle de MEK [23], induit une sénescence prématurée, avec augmentation de l’expression de p16INK4a ; l’hyperexpresion des facteurs transcriptionnels Ets1/2 par la voie Ras/Raf/MEK induit la transcription de INK4a, un blocage en phase G1 du cycle cellulaire et la sénescence prématurée des fibroblastes humains [23]. Ets1/2 activent le promoteur de INK4a en se liant directement à leurs sites consensus Ets : ainsi, les mutations Mut 1 et Mut 2 qui affectent les sites consensus Ets au niveau du promoteur du gène INK4a(Figure 1A) empêchent l’induction de son activité par Ets2 [23].

L’activité du promoteur de INK4a, normalement induite par Ets2 [24], est inhibée par la protéine LMP1 du virus d’Epstein-Barr : Ets2 ne s’associe pas au promoteur de INK4a, et s’accumule dans le cytoplasme alors que sa localisation normale est nucléaire et cytoplasmique. Par ailleurs, l’augmentation de l’expression de p16INK4a et la sénescence prématurée provoquée par l’oncogène Ras dans les FDH se trouvent inhibées par l’expression ectopique de LMP1.

Protéine bHLH E47

Les facteurs de transcription hélice-boucle-hélice basique (bHLH) possèdent un domaine HLH de dimérisation protéique, ainsi qu’un domaine riche en acides aminés basiques pour leur association avec l’ADN. Les protéines E, bHLH de classe A, sont exprimées de façon ubiquitaire et capables de former des homodimères. Les protéines bHLH de classe B, exprimées avec une spécificité tissulaire, forment des hétérodimères avec les protéines bHLH de classe A. Les dimères de protéines bHLH régulent la transcription des gènes en s’associant, par leur domaine basique, avec une séquence spécifique de l’ADN (CANNTG), nommée boîte E. Le promoteur de INK4a présente deux boîtes E (Figure 1A).

Une surexpression de la protéine E47, bHLH de classe A, inhibe la prolifération de certaines lignées tumorales humaines et active le promoteur de INK4a, tandis que la délétion des deux boîtes E abroge cet effet [25]. Par ailleurs, l’inhibition de l’expression de E47 par interférence par l’ARN (utilisation de siRNA) induit une diminution significative de l’expression de p16INK4a dans les FDH jeunes, et retarde leur sénescence réplicative [26]. À l’inverse, l’expression ectopique d’une protéine bHLH de classe B, Tal1, inhibe l’activité du promoteur du gène INK4a induite par la protéine E47, en formant avec elle des hétérodimères [27].

Inhibiteurs de la transcription

Protéines HLH Id

À la différence des protéines bHLH, les protéines HLH Id (Id-1,2,3,4) ne possèdent pas de domaine basique d’association avec l’ADN.

Ainsi, Id-1 est nécessaire à la progression des FDH jeunes en G1 [28], et différentes observations indiquent un rôle potentiel inhibiteur de Id-1 sur p16INK4a : l’expression de Id-1 est négativement corrélée à celle de p16INK4a au cours de la sénescence cellulaire [23,26] ; les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) Id-1+/+ expriment faiblement p16INK4a, tandis que les MEF invalidés pour Id-1 (Id-1-/-) l’expriment fortement [29] ; l’hyperexpression de la protéine Id-1 retarde la sénescence réplicative et inhibe l’expression de p16INK4a dans les cellules humaines [30, 31] ; enfin, l’augmentation de l’expression d’Id-1 est corrélée avec la diminution de l’expression de p16INK4a dans les mélanomes de stade précoce [32].

Il semble que les protéines Id inhibent la transcription de INK4a en se liant aux protéines bHLH ou Ets : en formant des hétérodimères avec E47 par leur domaine HLH, elles inhibent son association avec l’ADN au niveau des boîtes E [33] ; par ailleurs, Id-1 s’associe également à Ets2 [23], la formation des hétérodimères Id/Ets2 diminuant significativement l’activation du promoteur de INK4a par Ets2 lorsque les sites consensus Ets ne sont pas mutés [23]. L’ensemble de ces données suggère donc que la protéine Id-1 inhibe la transcription d’INK4a en empêchant E47 et Ets2 de se lier à leurs sites consensus au niveau du promoteur du gène.

Protéine Bmi1

Bmi1 est un répresseur transcriptionnel appartenant au groupe Polycomb (PcG). Les MEF invalidés pour Bmi1 (Bmi1-/-) présentent un phénotype de sénescence prématurée, avec augmentation de l’ARNm de INK4a et de ARF par rapport aux MEF l’exprimant (Bmi1+/+) ; l’expression induite de Bmi1 dans les MEF Bmi1-/- corrige ce phénomène [34]. Les MEF Bmi-1-/- INK4a+/+ présentent également un phénomène de sénescence prématurée, non observé dans les MEF Bmi1-/- INK4a-/- : le gène INK4a est donc une cible du facteur Bmi1, qui régule négativement sa transcription [34].

Une diminution de l’expression de Bmi1 est observée au cours de la sénescence réplicative des fibroblastes humains, et son hyperexpression provoque une diminution de l’expression de p16INK4a [35]. Le facteur Bmi1 humain possède en son extrémité aminoterminale un domaine en doigt RING (RF), impliqué dans l’interaction protéique, et un domaine central porteur d’une triple hélice-boucle (HT), ces deux domaines étant tous deux nécessaires à l’inhibition de l’expression de INK4a. De plus, différentes données expérimentales montrent que, chez l’homme, Bmi1 régule la prolifération et la sénescence cellulaire par inhibition de la voie p16INK4a/pRb, mais non de la voie p14ARF/p53 [35] ; cependant, le mécanisme de cette inhibition est encore très mal connu [36].

Régulation transcriptionnelle d’INK4a au cours de la sénescence cellulaire

Dans les fibroblastes diploïdes humains jeunes, l’expression de p16INK4a est faible ; en réponse à l’activation de la voie Ras/Raf/MEK, Id-1 contrebalance l’action de Ets1/2 et de E47 sur le promoteur de INK4a [23, 26] (Figure 2A).

Figure 2

Rôle de Id-1, Ets1/2 et E47 sur la transcription de INK4a dans les fibroblastes humains.

Rôle de Id-1, Ets1/2 et E47 sur la transcription de INK4a dans les fibroblastes humains.

A. Les cellules jeunes présentent une expression relativement faible de INK4a. Sous l’influence de signaux de prolifération, Id-1 contrebalance, par formation d’hétérodimères, la fonction activatrice des protéines Ets 1/2 (phosphorylées) et E47 [23, 26]. B. L’activation de la voie Ras/Raf/MEK entraîne une sénescence prématurée, accompagnée d’une forte expression de INK4a via une forte activation de Ets1/2 [13, 23]. C. Au cours de la sénescence réplicative, l’augmentation de l’expression de Ets 1 s’accompagne d’une diminution de l’expression de Id-1, le tout aboutissant à une augmentation de l’expression de INK4a [23, 26]. La transition de couleurs (du jaune à l'orange puis au rouge) reflète l’importance de l’expression protéique ; l’épaisseur des flèches reflète l’importance de l’activation ; –//→ : absence d’activation ; ↱ : transcription.

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Lors de la sénescence prématurée provoquée par l’activation de l’oncogène Ras, la forte activation de Ets1/2 entraîne une augmentation de l’expression de p16INK4a(Figure 2B) [13, 23].

Au cours de la sénescence réplicative, l’expression de E47 ne varie pas, celle de Ets1 augmente, tandis que l’expression de Id-1 et de Ets2 diminue ; parallèlement, l’expression de p16INK4a augmente. L’absence de MEK activé dans les FDH sénescents suggère que l’activation de Ets2, qui intervient dans les FDH jeunes en réponse à l’activation de la voie Ras/Raf/MEK, n’est pas ici responsable de l’hyperexpression de p16INK4a : celle-ci pourrait être liée à une augmentation, non encore expliquée, de Ets1, associée à une diminution de l’expression d’Id-1 et à une diminution de l’interaction entre Id-1 et E47 [23, 26] (Figure 2C).

Régulation épigénétique de l’expression de INK4a

Méthylation des îlots CpG

Le promoteur et l’exon 1 du gène INK4a présentent un îlot CpG [6] (Figure 1B) dont la méthylation, sur les résidus cytosine, inhibe la transcription du gène. Cette méthylation d’INK4a est retrouvée dans de très nombreuses tumeurs [6] ; INK4a pourrait donc être une cible privilégiée pour les traitements modulateurs de la méthylation, ou de l’acétylation. Les méthyltransférases de l’ADN (DNMT) sont importantes aussi bien pour la méthylation post-réplicative de l’ADN contenant des îlots CpG hémiméthylés (DNMT1) que pour sa méthylation de novo (DNMT3A/3B) ; de fait, la transcription de INK4a peut être réactivée dans différentes lignées tumorales humaines en inhibant les DNMT, par la 5-aza-2’désoxycytidine (5-aza-CdR) [37], ou spécifiquement l’enzyme DNMT1, par des oligonucléotides antisens ou des siRNA [38, 39].

Méthylation de l’histone H3

Les cellules HCT116 de cancer du côlon présentent un allèle sauvage de INK4a (INK4awt) inhibé par méthylation de l’ADN, et un allèle muté (INK4amut), non méthylé, produisant une protéine tronquée inefficace. L’invalidation des gènes codant pour les méthyltransférases de l’ADN DNMT1 et DNMT3B, par recombinaison homologue ciblée dans ces cellules, lève l’inhibition de INK4awt ; pourtant, au passage 22 après l’invalidation des deux gènes, INK4awt est à nouveau complètement inhibé, alors même que l’ADN n’est pas méthylé. En fait, la déméthylation de l’ADN est suivie de modifications post-traductionnelles des histones, par méthylation et acétylation ; or la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 est capable de provoquer l’extinction de INK4awt. Cette modification précède la méthylation de INK4awt et la désacétylation de H4 (toutes deux sont observées au passage 87), qui serviraient à maintenir la chromatine dans un état de répression spécifique [40] (Figure 3).

Figure 3

Régulation épigénétique de INK4a par modifications post-traductionnelles des histones et méthylation de l’ADN.

Régulation épigénétique de INK4a par modifications post-traductionnelles des histones et méthylation de l’ADN.

1. L’absence de méthylation de l’îlot CpG de INK4a et l’acétylation (A) des histones H3 ou H4 autorisent la transcription du gène [40]. 2. La méthylation de l’histone 3 sur sa lysine 9 (H3-K9, ) inhibe la transcription de INK4a et précède la méthylation de l’ADN (•) [40]. 3. La méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones entraînent un blocage spécifique de la transcription lié à l’action des complexes répresseurs MBD2/4 (protéines associées aux îlots CpG méthylés) et à la désacétylase d’histone (HDAC) [41-43]. L’inhibition des méthyltransférases de l’ADN (DNMT) et des HDAC rend au promoteur ses capacités transcriptionnelles [37-39, 41].

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Rôle des protéines MBD2/4

Différentes protéines (MBD1/2/3/4, MeCP1/2) peuvent s’associer par leur domaine MBD (methyl-CpG binding domain) aux îlots CpG méthylés [41, 42]. En absence d’acétylation de H3 et de H4, MBD2 (et MBD4) s’associent au promoteur méthylé de INK4a et recrutent des corépresseurs et des désacétylases d’histone (HDAC), entraînant ainsi une inhibition de la transcription du gène [42, 43].

Dans différentes lignées tumorales humaines, le traitement par la trichostatine A (TSA), un inhibiteur d’HDAC qui favorise l’acétylation des histones H3 et H4, mais n’induit pas de changement dans l’association entre MBD2 et le promoteur de INK4a, n’augmente pas l’expression de INK4a. En revanche, une augmentation, certes modérée, de l’expression de INK4a est observée dans les lignées traitées par la 5-aza-CdR, qui provoque une diminution de l’association entre MBD2 et le promoteur de INK4a, et une faible augmentation de l’acétylation des histones H3 et H4. Dans le même sens, un traitement combiné par 5-aza-CdR et TSA conduit à une forte induction de l’expression de INK4a. Les modulations de la méthylation de l’ADN et de l’acétylation des histones coopèrent donc pour réguler l’expression de INK4a [41].

Intervention de l’hélicase A de l’ARN

Le promoteur de INK4a comporte trois boîtes GC, sites consensus de fixation du facteur de transcription Sp1. Le rôle de Sp1 dans la protection de l’îlot CpG d’INK4a contre la méthylation a été examiné : les résultats montrent que le degré de méthylation du promoteur d’INK4a n’influe pas sur la liaison de Sp1 [44]. Lors de cette analyse, une liaison de l’hélicase A de l’ARN humain (RHA) sur le promoteur d’INK4a a été mise en évidence, au niveau d’une séquence 5’-CGGACCGCGTGCGC-3’ située en aval et chevauchant le site consensus de Sp1 (Figure 1A) ; l’intensité de cette liaison est inversement proportionnelle au degré de méthylation du promoteur, et pourrait être modulée par l’acétylation de la RHA ; de plus, l’expression de RHA exogène peut augmenter l’activité du promoteur de INK4a. Le facteur Sp1 seul n’est donc pas suffisant pour protéger des îlots CpG de la méthylation ; il est possible que la RHA augmente l’accessibilité du promoteur d’INK4a aux activateurs de la transcription tels que Sp1, le protégeant ainsi contre la méthylation de son îlot CpG [44].

Autres modifications épigénétiques

Le complexe SWI/SNF, qui appartient à la famille des facteurs du remodelage chromatinien dépendants de l’ATP, rend le génome plus accessible aux protéines associées à l’ADN en affaiblissant le contact entre les nucléosomes et l’ADN. Chez la levure, SWI/SNF modifie la structure du nucléosome en hydrolysant l’ATP grâce à sa sous-unité SWI2/SNF2-ATPase. Le complexe SWI/SNF humain (hSWI/SNF) contient, quant à lui, la protéine BRG1, homologue de SWI2/SNF2 [45]. Le gène SNF5 humain (hSNF5), muté dans les tumeurs malignes rhabdoïdes (MRT) qui code pour une sous-unité du complexe hSWI/SNF, stimule in vitro l’activité BRG1 ; surexprimé de façon expérimentale dans les MRT, le facteur hSNF5 s’associe au promoteur de INK4a et y recrute BRG1, entraînant alors une activation de la transcription de INK4a [45].

Les membres du complexe SWI/SNF sont des activateurs, appartenant au groupe trithorax, qui contrebalancent l’action d’inhibiteurs appartenant, quant à eux, au groupe des protéines Polycomb (PcG), telle Bmi1 : hSNF5 et Bmi1 pourraient ainsi fonctionner de façon antagoniste pour la régulation de INK4a. De fait, les protéines PcG regroupent au moins deux complexes protéiques distincts, le complexe répresseur 1 de Polycomb (PRC1) et le complexe ESC-E(Z) [46]. La protéine E(Z) aurait la capacité de méthyler l’histone H3 sur sa lysine 27 (H3-K27), signal de recrutement du complexe PRC1 sur l’élément de réponse à PcG. En bloquant l’accessibilité des facteurs du remodelage chromatinien tels que SWI/SNF, le recrutement de PRC1 s’accompagnerait alors d’une inhibition de l’expression des gènes [46] : la méthylation de H3-K27 pourrait donc interférer avec les rôles, antagonistes, de hSNF5 et Bmi1, ce qui souligne encore la complexité de la régulation transcriptionnelle de INK4a (Figure 4).

Figure 4

Mécanismes régulant la transcription de INK4a.

Mécanismes régulant la transcription de INK4a.

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Conclusions

L’analyse du promoteur de INK4a montre l’existence d’éléments de réponse pour d’autres facteurs de transcription dont l’action n’a pas encore été démontrée chez l’homme (JunB) [47], ou qui n’ont pas encore été identifiés (ITSE, INK4a transcription silence element) [48]. La dérégulation de nombreux mécanismes et facteurs participant à la régulation de INK4a a été associée au développement de divers types de tumeurs : méthylation aberrante du promoteur [6], inactivation du gène hSNF5 par mutation impliquée dans des tumeurs malignes rhabdoïdes [45], dérégulation de Bmi1 qui, par son interaction avec c-myc, est impliquée dans la lymphomagenèse chez la souris [49] ; forte expression de Tal1 (T-cell acute leukemia 1), impliquée dans la leucémogenèse [27]. L’analyse de la complexité des différents mécanismes de régulation de INK4a et une meilleure compréhension des modulations épigénétiques de son expression devraient permettre de développer l’utilisation rationnelle de nouvelles thérapeutiques, telles que les siARN ou les inhibiteurs de méthylases ou de désacétylases d’histone.

Appendices