Résumés
Résumé
L’épissage des pré-ARN messagers constitue une étape obligatoire pour la très grande majorité des transcrits primaires chez les eucaryotes. Il est sujet à de nombreuses variantes, ou épissages alternatifs, qui permettent l’assemblage de transcrits codant pour des protéines requises de manière transitoire ou traduisant une adaptation pathologique. Cette diversification du réservoir de transcrits augmente sensiblement la variabilité protéique. L’identification de mutations dans les séquences nécessaires à l’épissage ou à son contrôle a permis de déterminer les modifications d’épissage en relation avec le développement de maladies héréditaires ou cancéreuses. Rapidement, des approches ont été développées pour tenter de contourner de façon expérimentale l’effet de ces mutations, afin de restaurer un niveau d’épissage suffisant à une compensation fonctionnelle efficace. Les espoirs suscités par ces nouvelles approches méritent que l’on en prenne toute la dimension et que les perspectives thérapeutiques qu’elles offrent soient évaluées.
Summary
Pre-mRNA splicing operates towards at least 95 % of the transcript pool. It is subjected to a large number of variations, collectively regrouped under the term of alternative mRNA splicing, which occurs, on average, 6 to 8 times per pre-mRNA molecule. Consequently, many more proteins may be encoded from a single gene, which may satisfy a physiological need, or mark a pathological adaptation. The identification of mutations in sequences required for splicing, both constitutive and alternative, or for their control, has permitted to determine the causes of qualitative or quantitative variations in transcript levels associated with inherited diseases or cancer development. A number of molecular approaches have been undertaken to try to compensate for the effect of deleterious splicing mutations and to restore, at least in part, sufficient amounts of either the normal or a surrogate transcript. These include overexpression of splicing proteins, improvement of their activity by post-translational modification, splice-site increased or decreased usage, and RNA-mediated trans-splicing. Using such approaches, phenotypic improvements have been obtained in animal models, carrying new hopes for the development of therapeutic strategies aimed at correcting both inherited and acquired diseases that involve pre-mRNA splicing defects.
Corps de l’article
L’épissage des pré-ARN messagers concerne au moins 95 % des transcrits et constitue un préalable à l’exportation des messagers matures dans le cytoplasme, siège de la synthèse protéique. Il s’effectue de façon coordonnée avec la transcription et se déroule en deux étapes successives impliquant deux réactions de trans-estérification. Trois déterminants de séquence sont requis (Figure 1A) : les sites d’épissage 5’ (site donneur) et 3’ (site accepteur) situés aux jonctions exon-intron, respectivement en 5’ et 3’ de l’intron, et le site de branchement en amont du site 3’ accepteur. Cette réaction (Figure 1B) a lieu au sein du splicéosome, un complexe dont l’assemblage et le fonctionnement requièrent plus de 150 polypeptides et cinq ribonucléoprotéines, les snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), constituées d’une molécule d’ARN, l’ARNsn (snRNA), complexée avec sept protéines Sm ou apparentées et quelques autres protéines spécifiques [1]. Le splicéosome a deux fonctions : la reconnaissance des sites d’épissage et les étapes couplées d’élimination des introns et de re-ligation des exons. Plusieurs familles de protéines jouent un rôle majeur parmi lesquelles les protéines SR (riches en sérines et en arginines), hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) et CELF (CUG-binding protein and embryonic lethal abnormal vision-type RNA-binding protein 3-like factors) [2] (Figure 2). Un répertoire de séquences cis joue également un rôle déterminant lors de l’épissage [3] (Figure 2).
En 2004, environ 9,5 % des mutations répertoriées dans HGMD (human gene mutation database) affecteraient l’épissage (http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/docs/ hohoho.html). Les mutations de type I couvrent environ 60 % des mutations et touchent des séquences de sites d’épissage invariantes, ce qui abolit complètement la phase de définition de l’exon [4]. Les mutations de type II touchent les motifs variables. Dans le cas de la maladie de Menkes (défaut d’absorption hépatique du cuivre), une mutation d’un motif invariant du site donneur de l’exon 6 conduit à une forme très sévère, tandis qu’une délétion de 3 paires de bases (pb) du motif variable du même site donneur d’épissage conduit à une exclusion de l’exon 6 dans une fraction des transcrits et est associée à une forme moins agressive. Une mutation unique dans le dernier nucléotide de l’exon 18 du gène CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), associée à la mucoviscidose, crée un site cryptique conduisant à l’inclusion d’un nouvel exon de 84 pb. Le niveau de sévérité des atteintes pulmonaire et de l’épididyme est corrélé au taux d’inclusion de cet exon aberrant.
Épissage alternatif
On estime que 10 000 à 20 000 des gènes humains sont sujets à un épissage alternatif (EA) [5, 6]. L’analyse de représentativité de fragments de transcrits au sein des banques d’EST (expressed sequence tags) montre, en effet, que chaque ARN prémessager peut faire l’objet, en moyenne, de six à huit épissages distincts, et cela pour l’ensemble des eucaryotes analysés. En outre, une analyse, avec les banques d’EST, de 475 séquences protéiques variantes retrouvées chez des sujets porteurs de maladies suggère qu’au moins un tiers de ces protéines est issu d’un épissage alternatif [7]. Des données récentes indiquent que 70 % à 88 % des événements d’EA changeraient la nature de la protéine, et seulement 19 % conduiraient à la production de protéines tronquées [8]. Cette dernière observation résulte en grande partie du fait que l’EA est souvent associé à l’insertion de codons stop prématurés (situés en amont de la position occupée par le codon stop habituellement utilisé), ce qui peut être à l’origine de la production de protéines tronquées, mais surtout du mécanisme de nonsense-mediated mRNA decay [9]. Ce mécanisme est en effet très souvent observé si le codon stop est situé à plus de 50-55 nucléotides en amont de la dernière jonction exon-exon, et conduit à diminuer considérablement la stabilité des transcrits correspondants, donnant ainsi rarement lieu à la synthèse d’une protéine abondante. Ce mécanisme souffre de peu d’exceptions et est interprété comme une surveillance physiologique destinée à prévenir la production de protéines tronquées potentiellement délétères. Enfin, l’épissage alternatif peut être influencé par la transcription [10, 11]. Les différents types d’EA sont illustrés sur la Figure 3.
L’analyse de maladies d’origine génétique a été longtemps focalisée sur la recherche de mutations affectant la région codante des protéines. Plus récemment, un très large ensemble de mutations régulatrices a été répertorié. Ces mutations sont associées à la production de transcrits moins abondants, aberrants ou nouveaux, codant ou non pour des protéines normales ou modifiées. La majorité des mutations morbides touchent davantage les séquences de régulation que les régions codantes [2, 12, 13] et affectent également des protéines d’épissage [14] (Tableaux I et II).
Identification des événements d’épissage alternatif
Une étape déterminante dans la compréhension des mécanismes et du rôle de l’EA tient à l’identification, in extenso, des événements d’épissage. Des algorithmes spécifiques ont été développés et plusieurs approches expérimentales à haut débit ont été explorées (Figure 4). L’utilisation de sondes oligonucléotidiques fixées sur des filtres de forte densité a permis l’hybridation d’ARNm à des taux reflétant la spécificité tissulaire d’expression des gènes cibles [15]. Des méthodes plus sophistiquées utilisant des fibres optiques ont également été proposées [16]. D’autres méthodes destinées à identifier l’ensemble des transcrits alternatifs d’un gène donné ont été également rapportées [17, 18]. Un ensemble de sites web dédiés à l’EA est listé par L.F. Larreau et al. [19].
Exemples de maladies dues à des défauts d’épissage
Maladies d’origine génétique
La démence frontotemporale et le parkinsonisme liés au chromosome 17 sont dus à des mutations du gène MAPT(microtubule-associated protein tau) codant pour la protéine tau requise pour l’assemblage des microtubules. Des événements d’EA touchant les exons 2, 3 et 10 conduisent à la production d’isoformes aux extrémités amino- et carboxyterminales variables. Le rapport des isoformes de tau 4R (présence de l’exon 10)/3R (absence de l’exon 10) est déterminant pour spécifier le phénotype (il est d’environ 1 dans le cerveau normal) ; ce rapport est étroitement contrôlé par l’activité d’un ensemble de séquences ESE (exonic splicing enhancer), ESS (exonic splicing silencer), ISS (intronic splicing silencer) et une structure en épingle qui piège le site 5’ d’épissage.
Les amyotrophies spinales (spinal muscular atrophy, SMA) sont dues à des mutations du gène SMN (survival motoneuron, SMN1). Quatre-vingt-treize pour cent des patients sont porteurs d’une délétion homozygote qui emporte au moins l’exon 7, le reste des patients ayant une délétion hétérozygote avec présence sur l’autre allèle d’une mutation non-sens ou faux-sens. Ce gène est dupliqué, et une copie très homologue (SMNc ou SMN2) est présente chez 95 % de la population [3].
Le type 2 de la dystrophie myotonique est dû à une expansion de séquences CCTG dans l’intron 1 du gène ZNF9. C’est la longueur, dans l’ARN, du nombre de répétitions de CUG ou CCUG qui spécifie le degré de l’atteinte. Ces expansions de séquences seraient responsables d’une perte de l’activité d’épissage due à l’activation de la liaison spécifique de protéines des familles mbnl (muscleblind) sur ces séquences, conduisant à un phénomène de séquestration de ces protéines sur ces sites. Un phénotype comparable est d’ailleurs obtenu chez des souris dont le gène mbnl a été invalidé. Ce recrutement protéique incorrect conduirait à des épissages aberrants de plusieurs transcrits dont la troponine T cardiaque, le récepteur de l’insuline, le canal chlore spécifique du muscle, la protéine tau et une protéine apparentée à la myotubularine.
Des mutations inactivant l’assemblage ou la fonction des snRNP ont également été trouvées. Dans le cas de la rétinite pigmentaire, trois gènes codant pour des protéines du splicéosome, responsables de formes autosomiques dominantes, ont été identifiés (PRPF31, HPRP3 et PRPC8). Les mutations de PRPF31 incluent des insertions, des délétions, des mutations faux-sens et des mutations de sites d’épissage. La protéine correspondante est associée aux snRNP U4/U6 et U5 dont elle permet la trimérisation. La protéine HPRP3 est également un composant du complexe U4/U6 snRNP, au sein duquel elle serait capable de recruter HPRP4. Les mutations d’HPRP3 associées à des cas sporadiques de la maladie sont faux-sens ou non-sens dans deux codons conservés de l’exon 11. La protéine PRPC8 est également un constituant du splicéosome et le siège d’un ensemble de mutations toutes regroupées dans une région très conservée du dernier exon.
Modifications d’épissage associées à la tumorigenèse
Plusieurs observations ont permis d’associer des modifications d’épissage à la tumorigenèse [3]. D’une part, l’abondance relative de protéines SR augmente entre les stades prénéoplasique et métastatique dans un modèle de tumorigenèse mammaire chez la souris [20]. D’autre part, la transition, par augmentation de l’épissage alternatif, d’une forme de faible affinité vers une forme de forte affinité du récepteur 1 du FGF (fibroblast growth factor), est associée à la progression tumorale des astrocytomes [21]. Cet EA est favorisé en présence de la protéine PTB (polypyrimidine tract binding protein) dont le taux est augmenté. Le gène CD44 est impliqué dans l’adhérence et la migration cellulaires et peut coder pour des formes variantes de CD44, CD44v, associées à de nombreux cancers [22]. Le gène suppresseur de tumeur BRCA1 code pour une protéine nucléaire, mais, dans certains cancers du sein, un variant d’épissage dépourvu de l’exon 11 code pour une protéine dépourvue de signal de localisation nucléaire, suggérant la possibilité d’une perte de fonction de la protéine [23].
Compensations moléculaires
La meilleure compréhension des mécanismes de l’EA et l’identification des transcrits qu’il produit ont permis de développer des stratégies visant à modifier le taux de transcrits alternatifs, pour favoriser la synthèse de protéines « thérapeutiques » ou bloquer la production de protéines « indésirables » [14, 24].
Surexpression de protéines stimulant l’épissage
Les surexpressions de hnRNPA1 et du facteur d’épissage adénoviral E4-ORF6 permettent l’exclusion de l’exon 18 inséré dans un minigène CFTR, conduisant à une surproduction de transcrits normaux dépourvus de l’exon 18 [25]. La surexpression du facteur d’épissage Htra2-b1 permet une surproduction de transcrits normaux (incluant l’exon 7) du gène SMN2, de nature à complémenter le défaut chez les patients SMA porteurs d’allèles délétères du gène SMN1 [26]. Les protéines SC35 et hnRNPA1 ont des effets opposés sur l’inclusion de l’exon 9 dans un minigène Casp-2 et sur l’induction de l’apoptose [27].
Modification d’activité des protéines d’épissage
L’inhibition pharmacologique de la kinase Clk1/Sty, qui phosphoryle les protéines SR et augmente l’activité de la protéine d’épissage ASF/SF2 (alternative splicing factor/splicing factor 2), modifie l’activité d’épissage de transcrits sélectionnés [28]. Des composés synthétiques de type PNA (peptide nucleic acid) sont capables de recruter la machinerie d’épissage [29], et le butyrate ou le valproate de sodium induisent une augmentation du taux des transcrits SMN2, aboutissant à une rémission partielle dans un modèle murin d’atrophie musculaire spinale caractérisée par une perte d’expression, en rapport avec une mutation, du gène SMN1 [30]. L’aclarubicine, un inhibiteur de la topo-isomérase II, induit une redistribution des protéines SR, ce qui stimule également l’inclusion de l’exon 7 du gène SMN2 [31]. Des inhibiteurs des topo-isomérases I (camptothécine) et II (étoposide) induisent l’EA (en faveur de l’inclusion de l’exon 9) du pré-ARNm codant pour la pro-caspase-2 [32, 33]. En outre, les hormones stéroïdiennes stimulent également l’EA par l’intermédiaire du recrutement de transactivateurs spécifiques [34].
Blocage ou facilitation d’épissage avec des oligonucléotides
Des oligonucléotides destinés à inhiber l’inclusion de l’exon 23 muté du gène de la dystrophine dans le modèle murin des souris mdx (porteuses d’une mutation non-sens dans l’exon 23 du gène de la dystrophine, aboutissant à une protéine tronquée qui ne peut se localiser correctement au niveau du sarcolemme des fibres musculaires) permettent la synthèse et la localisation correctes de la dystrophine [35]. Récemment, une restauration phénotypique complète de fonction de la dystrophine a été obtenue chez ces souris, après injection de virus AAV (adeno-associated virus), permettant la production d’un transcrit élaboré de façon à induire l’exclusion de l’exon 23 porteur de la mutation et correspondant à une région répliquée non essentielle à la fonction de la protéine [36]. Des oligonucléotides antisens bifonctionnels, couvrant un domaine de ciblage couplé à une partie peptidique (PNA) contenant des ESE constituées de répétitions arginine-sérine, ont été utilisés [37, 38]. Le ciblage des transcrits BRCA1 et SMN2 par la méthode ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors) a été réalisé avec succès [38]. Une variante de cette méthode, TOES (targeted oligonucleotide enhancer of splicing), consistant en l’inclusion d’un domaine effecteur contenant une séquence cible de fixation de protéines d’épissage comme ASF/SF2, a permis le traitement de fibroblastes de patients SMA, avec un degré de correction (inclusion de l’exon 7 du gène SMN2) de l’ordre de 70 % [14]. Une approche similaire a été réalisée avec un oligonucléotide bifonctionnel capable de recruter la protéine hnRNPA1 et d’augmenter le rapport transcrits Bcl-xS/transcrits Bcl-xL, dans le but de promouvoir le potentiel pro-apoptotique [39] (Figure 5). L’interférence par l’ARN s’est également montrée efficace [40].
Le trans-épissage
Cette approche, appelée SMART (spliceosome-mediated RNA trans-splicing), repose sur le ciblage des pré-ARNm [14] (Figure 6). Elle a permis la correction du saignement, associé à la production de facteur VIII, dans un modèle de souris hémophiles [41]. Le trans-épissage a été également utilisé pour cibler des transcrits matures avec des ribozymes de groupe I [42]. Une troisième approche repose sur l’utilisation d’une endonucléase d’épissage des ARNt. L’endonucléase permet le clivage de l’ARN cible et de l’ARN correcteur apporté, avant que les étapes de cis- et de trans-épissage ne se déroulent. L’expression de l’endonucléase et de la séquence de ciblage a permis de reprogrammer un gène cellulaire dans des fibroblastes de souris [43].
À la lumière de ces différentes approches, il est concevable d’imaginer des combinaisons entre ces stratégies : par exemple, le cumul d’agents pharmacologiques agissant sur le taux ou l’activité des protéines SR et topo-isomérases avec des expériences de trans-épissage. La sélection forcée de promoteurs transcriptionnels, par l’utilisation de ligands de récepteurs nucléaires, pourrait également constituer une approche prometteuse permettant de diriger des épissages alternatifs spécifiques [34].
Conclusions
Outre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, la recherche systématique des événements d’EA pourrait permettre d’obtenir des canevas de référence quant au caractère prédictif potentiel, par exemple, d’un état précancéreux, ou de l’efficacité d’un traitement. Les possibilités nouvelles évoquées par les succès expérimentaux récents de compensation fonctionnelle suscitent de réels espoirs thérapeutiques. Les difficultés prévisibles appartiennent au registre des étapes requises pour le développement de médicaments. À celles-ci, s’ajoutent les obstacles inhérents aux approches de thérapie génique et cellulaire en termes d’efficacité, de « durabilité », et surtout d’innocuité à long terme. De plus, les « niches » constituées par les maladies génétiques rares risquent de représenter une priorité toute relative pour l’industrie pharmaceutique. En revanche, tous les intervenants en santé humaine seront sans aucun doute très motivés par le défi de l’élaboration de molécules à visée anticancéreuse. C’est probablement dans ce domaine que les attentes seront les plus nombreuses et les plus difficiles à satisfaire.
Parties annexes
Remerciements
Nous remercions vivement le Dr Jamal Tazi (CNRS, Montpellier) pour sa lecture du manuscrit. Merci également pour leur soutien à l’Inserm, la Ligue Nationale contre le Cancer, la Ligue contre le Cancer de Saône-et-Loire et le Conseil régional de Bourgogne.
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