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Comment modéliser les événements de la fibrose cutanée ?Models for skin fibrosis study : how to mimic skin fibrosis?

  • Marie-Catherine Vozenin-Brotons et
  • Alain Mauviel

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  • Marie-Catherine Vozenin-Brotons
    UPRES EA27-10,
    Institut de radioprotectionet de sûreté nucléaire/Institut Gustave-Roussy,
    39, rue Camille Desmoulins,
    94800 Villejuif,
    France.LRPAT/SRBE,
    Institut de radioprotectionet de sûreté nucléaire,
    92262 Fontenay-aux-Roses Cedex,
    France.Inserm U.697,
    Pavillon Bazin,
    Hôpital Saint-Louis,
    1, avenue Claude Vellefaux,
    75010 Paris,
    France.

  • Alain Mauviel
    UPRES EA27-10,
    Institut de radioprotectionet de sûreté nucléaire/Institut Gustave-Roussy,
    39, rue Camille Desmoulins,
    94800 Villejuif,
    France.LRPAT/SRBE,
    Institut de radioprotectionet de sûreté nucléaire,
    92262 Fontenay-aux-Roses Cedex,
    France.Inserm U.697,
    Pavillon Bazin,
    Hôpital Saint-Louis,
    1, avenue Claude Vellefaux,
    75010 Paris,
    France.
    alain.mauviel@stlouis.inserm.fr

Corps de l’article

La peau exerce une fonction de barrière essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme. Elle se trouve en première ligne de la réponse aux agressions environnementales d’ordre mécaniques, thermiques, chimiques ou radiatives. Cette réponse cicatricielle initiale consiste en la formation d’un tissu de granulation destiné à compenser rapidement la perte de substance et à restaurer sa fonction de barrière. Cependant, lorsque l’inflammation perdure, une réponse cicatricielle pathologique se met en place, conduisant au développement d’un tissu fibreux : ainsi, la fibrose intervient comme le processus ultime de l’inflammation chronique. Elle est caractérisée par une hyperplasie du tissu conjonctif, avec une prolifération et une différenciation des fibroblastes du derme en myofibroblastes qui conduit à une élaboration accrue de matrice extracellulaire. Cette hyperplasie conjonctive peut dans certains cas être associée à une acanthose [1, 2] ou à une atrophie de l’épiderme [3]. Si les étapes d’initiation de la fibrose peuvent être assimilées à un processus cicatriciel normal, les étapes chroniques se caractérisent par une non-résolution des signaux d’activation cellulaire, qui pérennise la prolifération et la différenciation myofibroblastique et l’accumulation de matrice extracellulaire. Le caractère chronique de la fibrose peut alors être perçu comme la conséquence d’une rupture de deux équilibres : celui qui régule l’état quiescent ou activé (état prolifératif et prosécrétoire) des fibroblastes du derme, et celui qui régule la synthèse et la dégradation de la matrice extracellulaire. En outre, l’évolution spontanée des tissus fibreux s’effectue vers une aggravation progressive de la pathologie, selon des mécanismes d’activation chronique encore mal connus.

La majorité des fibroses cutanées est consécutive à une agression tissulaire : cicatrices hypertrophiques, chéloïdes se développant après un traumatisme cutané (acte chirurgical, vaccin, acné, piercing…), fibroses chimio- ou radio-induites (séquelles tardives de traitements antitumoraux ou d’expositions accidentelles)… Le développement d’une fibrose cutanée est également observé chez les patients atteints de sclérodermie, une maladie rare impliquant le système immunitaire, existant sous deux formes, l’une localisée à la peau, l’autre systémique. L’étiologie de cette pathologie est encore mal connue, mais des causes génétiques, virales ou chimiques ont été identifiées chez certains patients.

Dans tous les cas, la perte d’élasticité cutanée causée par le développement de la fibrose engendre des troubles esthétiques (cicatrices) et fonctionnels (durcissement de la peau) particulièrement invalidants pour les patients, et contre lesquels il n’existe pas de traitement satisfaisant. La compréhension des mécanismes physiopathologiques, cellulaires et moléculaires contrôlant les processus d’initiation et de maintien des fibroses cutanées a donc nécessité le développement de plusieurs stratégies expérimentales in vitro et in vivo, afin de modéliser les processus complexes de fibrogenèse et de maintien de la fibrose au cours du temps.

Modèles cellulaires

Les fibroblastes dermiques assurent le contrôle de l’homéostasie matricielle, et sont donc considérés comme les acteurs cellulaires prépondérants des processus cicatriciels et des fibroses (Figure 1). Après une agression tissulaire, les fibroblastes du derme se différencient en myofibroblastes, cellules possédant des caractéristiques ultrastructurales et biochimiques intermédiaires entre celles des fibroblastes et celles des cellules musculaires lisses [4]. Un complexe d’adhésion focal transmet les signaux mécaniques et les forces contractiles de la cellule vers le micro-environnement, et inversement. La composition des fibres de stress (réseaux d’actine, myosine, tropomyosine, α-actinine et filamine) détermine la production des forces de traction nécessaires aux processus de contraction cicatricielle [5]. Les myofibroblastes possèdent également des capacités sécrétoires accrues : ils synthétisent des protéines de la matrice extracellulaire (collagènes, fibronectine…) en excès, ainsi que des facteurs de croissance participant de façon autocrine au maintien de la différenciation myofibroblastique.

Figure 1

La différenciation myofibroblastique au cours de la fibrose cutanée.

La différenciation myofibroblastique au cours de la fibrose cutanée.

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Plusieurs stratégies de culture cellulaire ont été développées pour étudier les mécanismes de différenciation myofibroblastique dans un contexte de fibrose : on distinguera les modèles adaptés à l’étude des mécanismes d’initiation de la différenciation myofibroblastique, et les modèles pertinents pour l’étude du maintien de cette différenciation au cours du temps (Figure 2).

Figure 2

Modèles d’études de la fibrose cutanée.

Modèles d’études de la fibrose cutanée.

A. Modèle d’initiation et de maintien de la différenciation myofibroblastique in vitro.B. Le tégument cutané porcin comme modèle expérimental de fibrose cutanée.

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Induction de la différenciation myofibroblastique

Cette stratégie consiste à induire la différenciation myofibroblastique in vitro en soumettant les fibroblastes du derme à des agents profibrosants exogènes (rayonnements ionisants, bléomycine) ou endogènes : facteurs de croissance (TGFβ1, CTGF/CCN2, PDGF), facteurs vasoactifs (angiotensine II, ET1), facteurs procoagulants (thrombine) et médiateurs inflammatoires (espèces oxygénées réactives, histamine, cytokines pro-inflammatoires). Ces différents stimulus permettent de mimer partiellement l’induction du phénotype fibrogénique, qui est alors acquis indépendamment du micro-environnement et sous l’action d’un nombre limité de facteurs paracrines.

L’exposition des fibroblastes du derme à des agents profibrosants exogènes augmente la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire via l’induction précoce du facteur profibrosant TGFβ1 [6]. En effet, l'apport exogène de TGFβ1 stimule la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes [7] par l’activation directe de la transcription des gènes de l’actine des muscles lisses de type α (α-sm actine) et des collagènes, et par la répression des gènes codant pour les enzymes assurant la dégradation de la matrice extracellulaire [8]. L’activation transcriptionelle des gènes des collagènes induite par le TGFβ1 dépend de l’activation du complexe Smad3/4, mais peut nécessiter l’intervention de facteurs de transcription, tels que Sp1, ou celle du cofacteur p300 [9]. D’autres cascades de signalisation peuvent également contribuer à la transactivation des gènes impliqués dans les processus de fibrogenèse, dont les voies associées aux protéines G et aux MAPK : ERK, p38/MAPK et SAPK/JNK [10].

Ces modèles miment de façon simplifiée l’étape d’acquisition du phénotype, mais ne reflètent que partiellement le profil de différenciation acquis au sein du tissu. En effet, in situ, le programme de différenciation myofibroblastique dépend des multiples facteurs environnementaux que sont les facteurs de croissance, les interactions cellules-cellules et cellules-matrice, ou encore les forces de tension mécanique. Aussi, afin d’étudier les signaux moléculaires responsables du maintien de la différenciation myofibroblastique, des modèles de culture de fibroblastes primaires isolés de tissus pathologiques ont été développés : ils permettent d’étudier un phénotype fibrogénique établi et acquis au sein d’un tissu.

Maintien de la différenciation myofibroblastique

Les myofibroblastes isolés de fibrose cutanée radio-induite conservent un phénotype sécrétoire et contractile analogue au phénotype pathologique in situ. Ils présentent une forte expression constitutive du TGFβ1, mais celle-ci n'engendre pas d’inhibition de croissance, peut-être à cause d’un défaut de translocation nucléaire de Smad3 [11]. Les fibroblastes isolés de peau de patients atteints de sclérodermie, quant à eux, présentent un défaut de régulation de la voie TGFβ1 corrélé à l’induction du récepteur de type I et/ou à une altération de l’activité de Smad3 [12]. Ces fibroblastes surexpriment constitutivement le CTGF, un amplificateur des signaux fibrogéniques, induit par le TGFβ1, qui semble nécessaire au maintien de la fibrose au cours du temps [13]. La comparaison des phénotypes des fibroblastes normaux soumis au TGFβ1 et des fibroblastes isolés de sclérodermie montre l’activation de voies de régulation différentes pour le contrôle de l’expression du CTGF : en effet, dans les fibroblastes sains, l’activation transcriptionnelle du CTGF par le TGFβ dépendrait de Smad3 et du site TEF, alors que dans les fibroblastes isolés de sclérodermie, la surexpression constitutive de CTGF ne dépendrait pas des élément de réponse au TGFβ (boîte Smad et TGFβ RE), mais plutôt de l’élément Sp1 présent dans le promoteur du CTGF [14].

Ces modèles de culture de cellules sont très pratiques pour la mise en évidence des dysfonctionnements cellulaires fins et persistant dans le temps qui illustrent le caractère chronique des fibroses in situ. En outre, ils permettent la mise en évidence de voies moléculaires et de modes de régulation spécifiques dans les cellules issues de fibroses tissulaires, permettant ainsi de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées.

Modèles de culture organotypique

Les modèles de culture cellulaire classique placent les cellules sur des supports en plastique qui modifient de façon substantielle la physiologie cellulaire. En revanche, les modèles de peaux reconstruites, qui replacent les cellules dans un environnement tridimensionnel en contact avec le stroma, permettent l’étude des processus de contraction et des communications intercellulaires.

Les systèmes de culture organotypique reconstituent un environnement dans lequel les processus d’adhérence cellulaire se produisent dans les trois dimensions de l’espace [15]. Dans ces modèles, la contraction matricielle se produit en réponse aux forces de traction exercées par les cellules. En retour, ce changement de conformation de la matrice induit une véritable régulation phénotypique. Ainsi, des fibroblastes ensemencés dans une matrice de collagène flottante deviennent quiescents en 24 heures, par inhibition de la voie ERK. En revanche, des fibroblastes ensemencés dans une matrice de collagène soumise à des tensions mécaniques se différencient en myofibroblastes, néosynthétisent l’α-sm actine, et contractent la matrice extracellulaire environnante, via l’activation des petites protéines G de la famille Rho et de leurs effecteurs ROCK [16].

Ces modèles de culture organotypique ont permis de mettre en évidence la capacité contractile accrue des fibroblastes cicatriciels [17], ainsi que la contribution directe des kératinocytes cicatriciels aux processus de fibrogenèse [18] : les kératinocytes stimulent ainsi la production de matrice extracellulaire des fibroblastes normaux et des myofibroblastes isolés de cicatrices hypertrophiques, grâce à des médiateurs encore inconnus.

Enfin, ces modèles complexes de culture organotypique permettent l’étude des mécanismes d’action de molécules thérapeutiques antifibrosantes in vitro, notamment des antioxydants [19].

Modèles animaux

Même si les modèles expérimentaux fondés sur la culture cellulaire, tels ceux décrits ci-dessus, permettent des avancées significatives dans la compréhension des mécanismes moléculaires d’activation et de régulation des fonctions fibroblastiques, les processus fibrogéniques n’en restent pas moins beaucoup trop complexes pour n’être étudiés qu’in vitro. En effet, les fibroses résultent de la conjonction des phénomènes complexes de ré-épithélialisation, d’activation vasculaire et inflammatoire, de dépôt de matrice extracellulaire et de contraction, qui nécessitent des systèmes physiologiques intégrés afin d’être appréhendés dans leur ensemble : c’est pourquoi des modèles expérimentaux animaux sont indispensables, d’autant qu’ils présentent l’avantage de permettre la validation de nouvelles approches thérapeutiques, ensuite extrapolables à l’homme.

La peau du porc domestique présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles (pilosité, structure collagénique, vitesse de renouvellement des kératinocytes, caractéristiques enzymatiques) semblables à celle de l’homme. Par ailleurs, l’adhérence de la peau au tissu sous-cutané et la structure du réseau lymphatique impliquent des processus cicatriciels similaires chez le porc et l’homme. Le tégument cutané porcin constitue donc un modèle pertinent d’étude des fibroses cutanées, notamment radio-induites [20].

Les modèles murins sont également très utilisés, malgré d’importantes différences entre les peaux murine et humaine : épaisseur totale de la peau (400 µm chez les rongeurs, contre 1 400 µm chez l’homme), épaisseur de l’épiderme (10 µm chez les rongeurs, contre 60-90 µm chez l’homme), densité des follicules pileux (1 000/mm2 chez les rongeurs, contre 25/mm2 chez l’homme), structure vasculaire superficielle et absence d’adhérence aux tissus sous-cutanés chez la souris, par exemple. De plus, les mécanismes cicatriciels des rongeurs produisent peu de tissu de granulation et, en conséquence, la fibrogenèse est rare. Si ces modèles ne reproduisent que partiellement les processus complexe de la fibrogenèse humaine, ils conviennent néanmoins à l’étude de certains paramètres précis de la fibrose.

Modèles d’induction exogène de la fibrose

Les agents profibrosants exogènes, tels que la bléomycine (injection sous-cutanée quotidienne) ou les rayonnements ionisants (irradiation localisée à forte dose), produisent une réponse inflammatoire et vasculaire aiguë, qui évolue vers une ulcération épidermique majeure et une fibrose très cellularisée et riche en matrice extracellulaire en 4 à 5 semaines. Ces stratégies emploient des agressions tissulaires très sévères et produisent des fibroses à évolution rapide, conséquence des lésions initiales aiguës : elles sont donc difficilement assimilables aux fibroses induites par les traitements antitumoraux de chimio- ou radiothérapie, qui sont des séquelles plus tardives, ne se développant pas nécessairement après des lésions aiguës sévères ; en revanche, ces protocoles permettent d’étudier les voies moléculaires impliquées dans la fibrogenèse.

Le développement des fibroses cutanées chimio- et radio-induites est partiellement inhibé chez les souris déficientes en Smad3 [21-22], ce qui confirme l’implication de la voie du TGFβ dans le contrôle de la fibrogenèse. Les études mettent également en évidence des particuliarités liées à l’agent inducteur : dans le modèle radio-induit, les souris Smad3-/- montrent une diminution de l’atteinte épithéliale (moins d’acanthose, d’ulcération et d’hyperkératose), de l’inflammation intradermique, de l’expression du TGFβ et du nombre de myofibroblastes, alors que, dans le modèle chimio-induit (bléomycine), la cible principale semble être le fibroblaste, car la déficience en Smad3 n’induit pas de modification de la réponse inflammatoire précoce.

Le modèle murin Scl GVHD représente également un modèle de fibrose cutanée fulgurante, qui mime une forme sévère de sclérodermie humaine à évolution rapide. Cette fibrose est obtenue par greffe de cellules de moelle osseuse et de rate chez des souris irradiées à dose létale. Dans ce modèle, les atteintes épithéliales et vasculaires sont mineures, tandis que les monocytes/macrophages et des lymphocytes T déclenchent la réponse fibrogénique : production de chimiokines de la famille C-C (MCP-1, MIP1α et RANTES), qui exercent une action chimiotactique sur les cellules immunocompétentes et entretiennent la réponse inflammatoire aiguë, et libération de TGFβ1, qui stimule la différenciation des fibroblastes et la synthèse de matrice extracellulaire (Figure 1). Dans ce modèle, la neutralisation du TGFβ, par un anticorps ou par le LAP, prévient le développement de la fibrose [23].

Modèles de prédisposition génétique, modèles génétiquement modifiés

L’existence de facteurs de prédisposition génétique a été mise en évidence par l’observation d’une réponse fibrogénique différente dans deux lignées murines : les souris C57BL6 présentent un phénotype profibrosant, tandis que les C3H sont relativement résistantes au développement des fibroses radio-induites cutanées, pulmonaires ou intestinales. Plus récemment, des locus chromosomiques de prédisposition au développement des fibroses pulmonaires ont été décrits sur les chromosomes murins 1, 6, 17 et 18. La région radpf-1 du chromosome 17, située dans le complexe majeur d’histocompatibilité, semble notamment être un locus « universel » de prédisposition à la fibrose, puisqu’il est génétiquement lié au développement des fibroses radio-induites, chimio-induites ou particulaires ; la région radpf-1 contient des gènes potentiellement impliqués dans le développement des fibroses, notamment ceux codant pour le TNF, la MnSOD, le plasminogène ou p21 [24].

Le modèle murin TSK (tight skin) présente un phénotype analogue à celui des sclérodermies systémiques (accumulation de matrice extracellulaire dans la peau et les vicères). Cette mutation spontanée, létale à l’état homozygote, touche le gène de la fibrilline-1 et cause une altération structurale des microfibrilles, ainsi que la production d’auto-anticorps dirigés contre la protéine mutante chez les hétérozygotes. Chez les animaux TSK+/-, le dépôt collagénique intradermique dépend des lymphocytes B CD19, via une production combinée d’auto-anticorps et de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 [25].

Conclusions

Les modèles d’étude de la fibrose cutanée ont permis d’appréhender la complexité des mécanismes physiopathologiques de la fibrogenèse et du maintien de la fibrose. Ces travaux, qui montrent que les fibroses sont des phénomènes dynamiques, permettent d’envisager des interventions thérapeutiques ciblées, préventives aussi bien que curatives.

Parties annexes